Kako ustanoviti Hiša Patch – Clamp Experiment
je patch- clamp eksperimentza merjenje posamezne živih celic . To počne z zelo fino pipete tesno potekala pred membrano enotnega celice (zunanji zaščitni ovitek ). Odprtje te pipete je le približno 1 mikron (ena tisočinka milimetra ) in optično nadzoruje z mikroskopom . Celice se hranijo enotno v posodo uporabimo celico Detacher kot so tripsin . Posebna celica je izbrana inkapalko se postavi na celično membrano . Tesen pečat je oblikovan s pomočjo sesalne in del membrane je sestavljen v pipette.Things boste potrebovali
Cell ploščo
fosfatnim pufrom ali PBS ( brez kalcija in magnezija )
Tripsinski
inkubator
10 – mililitrski pipeta jezik HEK (humani epidermalni keratinocyctes ) srednje
fetalni telečji serum ( FCS ) jezik centrifuga
zunanjih rešitev za snemanje
patch clamp chip
Twist cap
elektrode
Proste Prikaži več navodil
1
Pridobite ploščo za celice . Operite tablici dvakrat s 10 ml PBS ( fosfatnega pufra s fiziološko raztopino ) brez kalcija in magnezija . Dodamo 2 ml detacher ( tripsin ). Inkubiramo Plošča tri minute pri 37 stopinjah Celzija . Plošča pod mikroskopom , da se zagotovi , da se celice ločijo. Nežno premakniti ploščo ločiti vse celice z dna plošče . Dodajte 10 mililitrov HEK ( človekove epidermalni keratinocyctes ) in FCS ( serum krava ploda) srednje . Uporabite 10 – mililitrskih pipeto , da se premaknete celice gor in dol .
2
Upoštevajte celice pod mikroskopom , da se zagotovi , da so posamezne celice . Odpipetiramo z uporabo 10 – mililiter pipeto , dokler so celice , ena , če je potrebno . Centrifuga celice dve minuti pri 1000 obratov na minuto . Supernatant zavržemo . Postavite celice v 10 mililitrov fetalni telečji serum . Ponovno centrifugiramo celice dve minuti pri 1000 obratov na minuto . Supernatant zavržemo . Postavite celice v 200 ul zunanjega rešitev za snemanje . Upoštevajte celice pod mikroskopom za posamezne celice z gladko membrano.
3
Postavite solne raztopine v notranjosti patch clamp čipu . Dodamo kapljico medceličnega elektrolitske raztopine v spodnjem delu čipa s pipeto . Mount čip na twist pokrovčkom . Zasuk cap mora vsebovati referenčno elektrodo in sesalno cev . Dodamo kapljico zunajcelični elektrolitske raztopine na vrhu čipa s pipeto . Elektrolitske raztopine omogoča čip ustvariti stik z elektrodo . Dodaj 5 , ul suspenzije celic s solno raztopino na čipu . Postavite eno celico s pomočjo sesanja skozi pipeto . Sesanje se lahko izvede ročno sesanje zraka skozi pipeto . Pozicioniranje odpornost Povečanja celic , da se tvori tesnjenje . Tesnilo omogoča preiskavo celotne celice.