Kako umerimo gelsko filtracijo stolpce

so gelsko filtracijo stolpce uporablja za ločevanje proteinov iz kompleksne zmesi. Ker ima vsak protein edinstveno molekulsko maso , so lahko inducirane za ločevanje v različnih slojev , ki so jih selijo skozi filtracijsko kolono, ki vsebuje enakomerno porazdeljeno matriko gel . Za pravilno identificirati vsak protein , ki je ločeno ven, boste morali umeriti stolpce z več proteinov znanih molekulskih weight.Things boste potrebovali
karboanhidrazo
citokrom C
aprotininske
bazalnih sol
Centrifuga cevi
feritin
Centrifuga
pipetiramo črpalka
250 ml merilni valj
Buffer tekočina
Znanstveno čiščenje krpice
brizgalke
Prikaži več navodil

1

Odstranite vial karboanhidraze , citokroma C in aprotinin iz hladilnika ali zamrzovalnika in jim omogoči, da doseže sobno temperaturo . Med 4 mg vsakega proteina v epruveto za centrifugiranje na mililiter gela v stolpcu filtracije . Dodajte 961 MCL bazalnega soli na miligram proteina za vsako epruveto za centrifugiranje za raztapljanje proteinov . Dodaj 39,2 MCL feritina na mililiter gela za vsako epruveto in nato zmešamo v centrifugi .
2

Izklopite stolpca filtracija črpalko in zaprite zaporni ventil na vhodu kolone . Odviti , a ga ne odstranite , na vrhu stolpa filtracije. Nastavitev črpalko na maksimalno hitrost pretoka za stolpec in znova črpalko , doklervarovalni materiala posesa . Ustavite črpalko .
3

Dodamo 1 ml vsake beljakovin v stolpcu filtracijo z uporabo pipete črpalko . Kaplja proteine ​​s sten kolone z višine 1 cm do 2 cm , deluje okoli notranjega roba kolone . Pustimo, damešanica beljakovin , da se usede na vrhu matrice gel .
4

Postavite odvodno cevje črpalke v čisto, suho 250- ml merilni valj . Znova zaženite črpalko s hitrostjo 0,30 ml na minuto in vodijo beljakovine v matrico gel . Medtem kočrpalka deluje , izpiranje stranice cevi s pomočjo pipete črpalko in majhno količino puferska tekočina . Ko so proteini v celoti vstopila v matriko gel , zmanjšajte hitrost črpalke in 0,02 ml na minuto in črpalko za 5 cm do 7 cm plast varovalnega tekočine na vrhu matrice.
5

Odklopite stolpec kapa iz ventila. Pokrovček stolpca in notranjost kolone s pomočjo znanstvene čistilne krpice očistite . Ponovno namestite pokrovček stolpca. Izpolnite varovalni rezervoar s pufrom tekočino. Pritrdite brizgalke na petelinčka in ga odprite. Uporabite brizgo , da pripravi majhno količino pufra skozi cevi in v brizgo . Zaprite ventil in ga ponovno namestite na stolpec vrhu. Odpremo ventil in preverite tesnjenje .
6

Run kolono na 0,02 ml na minuto, za nekaj dni , doklerferitin bend bliža koncu kolone . Zberi vse gel za filtracije , ki se prečrpa v jeklenki .